酶制劑在食品工業中應用廣泛，其具有綠色環保和可持續發展的特性，然而，苛刻的工業生產條件嚴重制約著酶在食品工業中的廣泛應用。針對天然酶在工業化應用中存在的穩定性差和催化活性低等問題，借助計算機模擬技術改造獲得性能優良的酶，是解決該問題的常用策略之一。
為了滿足規?；?、集約化的食品工業發展需求，研制性能優良的食品工業用酶制劑，對食品工業的快速發展具有重要的意義。酶工程改造中借助計算機模擬技術可以更高效地獲得突變體，減少試驗工作量和縮短試驗周期，極大促進了人們對酶結構與功能構效關系的認識。隨著計算機硬件和理論方法的發展，大數據及深度學習、人工智能的方法也開始應用在食品工業用酶改造中。這一數據驅動的技術為蛋白質工程提供了新的開發思路，未來計算機輔助酶設計將向著更加智能和高效的方向發展。
酶是一類具有高效催化活性的蛋白質，催化活性與其三維結構密切相關。高溫、高壓、高滲透壓、極端pH值等食品工業生產環境會破壞酶的三維結構使其失活，從而極大限制了其在食品工業領域中的應用。針對此問題，對食品用酶進行結構改造以提升其催化性能，或者從頭設計獲得自然界中不存在的酶就變得非常必要。
常用的蛋白質改造方法主要有隨機進化、半理性設計和理性設計3種。隨機進化是在實驗室中模擬自然進化，構建隨機突變體文庫，通過多輪迭代獲得性狀改善的突變體，然而突變體文庫受庫容量及高通量篩選方法限制，有益突變體占比不高。為進一步提升定向進化的效率，（半）理性設計應運而生。該技術基于酶的結構與功能，借助計算機輔助設計方法發現潛在突變位點，設計小而精的突變文庫，從而針對性設計和改造蛋白質，是目前研究的熱點之一。
食品工業常用酶制劑分類
食品工業用酶制劑作為一種高效、安全、環保的生物催化劑以它獨特的優勢在食品工業中起著重要作用。酶制劑的使用能夠改變食品的形狀和質地，增加食品的營養功能，改善食品風味。食品工業酶制劑現已廣泛應用于乳制品、食品釀造、肉類、焙烤、飲料、果汁和啤酒等食品工業中。目前食品工業中常用酶的種類超過55種，主要包括：α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、谷氨酰胺轉氨酶、普魯蘭酶、葡萄糖異構化酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶等。表1列出了常見的食品工業用酶制劑及其用途。
表1 常見的食品工業用酶制劑及其用途
食品工業用酶設計的分子模擬方法
食品工業生產過程中的極端條件不適合大多數天然酶充分發揮其催化性能。除了定向進化實驗技術之外，利用計算機模擬技術理性設計獲得在工業環境中性能優良的酶也是常用的方法之一。計算機模擬輔助酶工程改造通過分析蛋白序列、結構與功能之間的關系，預測突變位點，限定突變范圍，可顯著增加有效突變體的占比，從而大大縮短實驗周期，減少實驗工作量和節省成本。在食品工業用酶分子設計中常用的計算工具主要有以下5類：同源建模、分子對接、分子動力學模擬、自由能計算和在線網絡預測服務。
同源建模
蛋白質的三維結構決定其功能。酶的高效特異催化性能依賴于其錯綜復雜的三維結構。目前蛋白結構解析主要有X射線晶體衍射、核磁共振及冷凍電鏡技術3種試驗方法。上述方法存在各自的局限性：X射線晶體衍射必須獲得優質的蛋白晶體，然而有些食品用酶不易體外表達或結晶；核磁共振不能解析分子質量大的蛋白質；冷凍電鏡價格昂貴、普及率較低。與已測得的龐大數量的蛋白序列相比，目前解析出的蛋白結構非常少。鑒于此，采用計算機模擬技術預測蛋白三維結構就顯得尤為重要，而同源建模是目前應用較為廣泛的方法之一。依據蛋白序列同源性決定結構同源性的原則，可通過同源性較高且結構已知的蛋白為模板構建目標蛋白的三維結構。構建流程包括：目標序列的搜索、序列比對、模型構建和結構優化與評價。一般而言，目標序列與模板序列的同源性越高，構建的模型越準確。當兩者序列同源性小于30%時，得到的目標蛋白結構準確性較差，不建議使用該技術來構建其三維結構。目前同源建模常用的軟件有Modeler和SWISS-MODEL等。
分子對接
分子對接是將小分子配基置于蛋白的結合位點處，基于特定的算法搜尋其合理的取向和構象，使得配基與目標蛋白的形狀和相互作用都能較好地契合，從而形成互相匹配的結合模式。根據分子對接過程中是否考慮配基和目標蛋白的柔性，可以將分子對接分為3類，即：剛性對接、半柔性對接和柔性對接。剛性對接是指在對接過程中配體和受體都為剛性的，對接過程中構象不發生變化。該方法計算量和計算難度較小，然而，對接的準確性較差。半柔性對接指在對接過程中僅考慮配體的構象變化，受體構象固定不變，其準確度和計算量均適中，因此半柔性分子對接是目前應用較為廣泛的方法。柔性對接是指在對接過程中受體和配體的構象均不受限制，可以自由發生變化。與前兩種方法相比，該方法準確度更高，然而計算量也大幅增加，只適用于較小的模擬體系。目前常用的分子對接軟件為Glide、AutoDock、DOCK和GOLD等。
分子動力學模擬
分子動力學（MD）模擬是基于經典力學和統計力學的理論，根據隨機給定的初始位置和勢能函數計算出作用在粒子上的力，利用經典的牛頓運動方程，通過數值積分得到下一時刻體系的構象，如此反復，最終獲得體系構象隨模擬時間的變化軌跡。分子力場是經驗勢函數，分子力場的參數是根據試驗測量值或從頭計算擬合得到。目前已開發出針對生物大分子（如蛋白、DNA、RNA及脂質）的全原子力場，小分子力場參數可通過量化計算獲得?；贛D模擬計算除了可以獲得模擬體系動態的結構信息外，還可獲得詳細的蛋白-蛋白、蛋白-小分子之間的相互作用。MD模擬流程一般包括：結構轉換、溶劑環境的構建（不同pH值、溶劑及模擬溫度）、能量最小化、平衡模擬、采樣模擬和模擬數據分析。目前MD模擬常用的軟件有Amber、Gromacs、CHARMM和NAMD等。
自由能計算
自由能計算方法可定量分析蛋白—蛋白、蛋白—小分子之間的結合作用力。近年來已發展出多種自由能計算方法，包括經典的自由能微擾理論、熱力學積分和分子力學-泊松玻爾茲曼表面積自由能計算方法等。自由能微擾和熱力學積分的計算結果雖精確，但需要的計算資源較多，且計算時間長?；贛D模擬軌跡，利用MM-PBSA自由能計算方法可以分別獲得分子力學作用能、極性溶劑化作用能和非極性溶劑化作用能。由于MM-PBSA計算極性溶劑化作用能時采用隱式溶劑模型，因此兼顧了計算精度和效率，被廣泛應用于底物-酶相互作用模式研究。
在線網絡預測服務
為了方便初學者的使用，研究人員開發出用戶友好操作簡單的在線網絡服務來提高計算機模擬的可及性。突變引起的折疊自由能變化（△△G）與突變體的熱穩定性密切相關，△△G小于0表明突變后蛋白質的穩定性得到提升，反之則表明突變會造成蛋白質穩定性的喪失。為了提高在線網絡預測的準確度，目前已開發出3種類型的打分函數（即基于機器學習、基于統計和基于力場）來評估突變對酶穩定性的影響。常用的在線網絡服務包括：I-Mutant、FoldX、PoPMuSiC和ddg_monomer。
B因子（B-factor）是一個從X射線數據中獲得的原子位移參數，反映因熱運動而導致的電子密度相對于其平衡位置的振動程度。B因子常用來鑒定蛋白質單個殘基的柔性。針對B因子較大的氨基酸進行替換，可降低酶結構柔性，從而提升蛋白質的熱穩定性?；诘鞍仔蛄屑敖Y構的B因子預測方法主要有B-FITTER和FIRST。
二硫鍵是蛋白質中相鄰兩個半胱氨酸側鏈巰基脫氫形成的共價鍵，對維持蛋白質的天然構象和穩定性有重要作用。試驗數據表明，每一個天然的二硫鍵能為蛋白質的穩定性貢獻2.3—5.2千卡/摩爾的能量，因此，在合適位置引入二硫鍵可極大地提升蛋白質熱穩定性。常用的在線預測軟件有SSBOND、MODIP、DbD2和BridgeD。表2列出了食品工業用酶設計過程中常用的在線網絡工具及所需的輸入文件。
表2 食品工業用酶設計的在線網絡工具
計算機模擬方法在食品工業用酶改造中的應用
現代食品工業中的極端環境往往會破壞天然酶的構象，使其酶活降低甚至完全失活。為了獲得性能優良的工業酶制劑，可利用計算機模擬技術進行合理設計。
提升酶的熱穩定性
食品工業過程常涉及高溫條件操作，因此對工業用酶的耐高溫能力有很高的要求。例如，高溫普魯蘭酶具有降低糖化溶液黏度和強化傳質等優點，然而，目前大多數普魯蘭酶是中溫型的，為了提高該酶的耐高溫能力，利用在線計算工具預測正向突變點是目前常用的策略之一。Bi等利用I-Mutant/FoldX在線網絡工具預測酶的單點突變穩定性，獲得芽孢桿菌普魯蘭酶突變體G692M。該突變體在70℃時Tm比野生型升高3.8℃，半衰期延長2.1倍（見表3）。此外，作者還利用MD模擬解析了該突變體熱穩定性提高的分子機制：降低區域690—700的RMSF值，增強該區域的剛性，最終提高了該酶的熱穩定性。有時單點突變的效果不明顯，需要通過多點突變來獲得穩定性更高的酶。Chen等綜合利用BFITTER/PoPMuSiC計算工具預測潛在突變位點，獲得普魯蘭酶多點突變體E518I-S662R-Q706P，該酶的最適溫度從60℃提高到65℃，60℃下的Tm升高了9.5℃，半衰期延長11倍。MD模擬分析表明多點突變增加了酶分子內的氫鍵、疏水和靜電相互作用。另外，662位的精氨酸取代也可能對酶熱穩定性有所貢獻。前期研究表明，精氨酸出現在嗜熱蛋白表面的頻率較高，這一策略也用于提高淀粉酶和α-L-鼠李糖苷酶的耐熱性能。
單一計算策略提升酶穩定性效果有限，多種計算策略聯用可大大提高其計算效率。Janssen等開發了FRESCO流程，該流程綜合利用計算機模擬軟件Rosetta DDG、FoldX和二硫鍵Dynamic Disulfide Discovery算法預測潛在突變點，然后利用MD模擬去除結構不合理的突變體，最后通過試驗驗證突變體的耐高溫能力。目前已利用FRESCO策略獲得了許多耐高溫的酶，包括環己酮單加氧酶、脂肪酶、植酸酶和羰基還原酶等。
由于脯氨酸具有特殊的吡咯烷結構，比其他殘基具有更少的構象自由度，因此脯氨酸取代也是提升酶熱穩定性的常用方法之一。針對脂肪酶熱穩定性不高的問題，Zhang等通過試驗與計算機模擬結合的方法獲得了耐高溫酶。整個試驗流程如下：（1）同源建模野生型酶的三維結構；（2）野生型酶在不同溫度下的MD模擬，以此確定RMSF值較高的氨基酸殘基位點，這些位點通常意味著所在區域構象不穩定，對這些位點進行脯氨酸替換可降低主鏈構象自由度，增加蛋白質穩定性；（3）再次利用MD模擬來篩選熱穩定性好的突變體；（4）試驗驗證突變體的耐高溫性能。利用上述試驗方法改造獲得耐高溫的突變體V213P。結果表明，V213P突變體最適溫度比野生型高5.0℃，半衰期比野生型延長了70%。
提升酶的酸堿穩定性
極端pH值也是影響酶在工業化應用的關鍵因素之一。常規α-淀粉酶在低pH值條件下易失活。為了提高其耐酸性，Yang等首先基于枯草芽孢桿菌α-淀粉酶三維結構，選擇位于活性位點空腔內的堿性組氨酸His222、His275、His293和His310作為突變點，分別用酸性天冬氨酸替換得到4個單點突變體，其中H222D突變體失活；進一步構建兩突變和三突變體，最終獲得耐酸性最好的突變體H275D/H293D/H310D，該突變體在pH4.5時Kcat/Km提高16.7倍，保溫24h后初始活性保留92%，約為野生型3倍。類似的突變策略用于GH11木聚糖酶，基于氨基酸序列比對的分析結果，將堿性精氨酸、賴氨酸突變為谷氨酰胺和蘇氨酸，得到的兩株突變體比野生型具有更高的耐酸能力，在pH3的環境下，催化活性分別提高50%和40%。反之，用堿性氨基酸替換酸性氨基酸，可提高酶在堿性環境下的穩定性。例如：增加木聚糖酶中“絲氨酸/蘇氨酸表面”的精氨酸數量后，突變體最適pH值比野生型酶最適pH值高。
提升酶的催化活性
利用計算機模擬解析酶的催化機理，進而通過適當增加底物與活性位點之間的親和力提高酶的催化性能。Chen等結合同源建模和分子對接模擬技術發現I-鼠李糖異構酶的催化口袋中柔性loop環對底物的親和性影響較大。為了提高其催化活性，將位于loop環上的疏水殘基用極性氨基酸替換獲得V48N/G59N/I63N和V48N/G59N/I63N/F335S突變體，結果表明：上述兩個突變體的催化活性均得到大幅提高。最后，利用MD模擬揭示了催化活性提高的分子機制為兩個關鍵殘基突變（V48N和F335S）使得催化口袋收縮，從而增強了酶與底物分子中C6位羥基的相互作用，最終提高了酶對底物的親和性（見表3）。類似的策略也應用于高效GH10木聚糖酶的改造。
表3 利用計算機輔助技術結構改進食品工業用酶性能應用實例
N-糖基化修飾同樣也能提升酶的催化性能。N-糖基化修飾位點的選擇至關重要。為了選擇合適的修飾位點，Wang等基于β-葡萄糖醛酸苷酶的序列和三維結構分析，選取位于loop/turn區域且遠離活性中心的糖基化位點，獲得3個糖基化的突變體。其中N28位糖基化突變體的Km減小，Kcat/Km增加，表明突變體與底物的親和力增強，催化效率提升。同樣的策略應用到β-木糖苷酶、過氧化物酶中，通過增加N-糖基化位點均成功提高了酶的催化活性（見表3）。
（路福平 黃愛嵐 趙蕾 劉曉鳳 郭宵 陳寧 劉夫鋒）
